质粒转染和病毒转染有什么本质上的区别? pei质粒转染的原理?

质粒转染和病毒转染有什么本质上的区别?

两者在本质上并没有区别。无论是质粒转染,还是病毒转染,均是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。扩展资料:转染的原理:外源基因进入细胞主要包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

质粒转染和病毒转染有什么本质上的区别? pei质粒转染的原理?

pei质粒转染的原理?

多胺和新一代转染介质: 多胺其实也是氨基多聚物, 原理无非基于吸附带负电的核酸形成非 共价结合的复合物,结合并穿越同样带负电的细胞膜。瞬时转染是指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内(主要指HEK293细胞),该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上…

转染步骤?

稳定转染实验操作

质粒构建:目的基因构建至载体上,随后对质粒进行线性化处理以便于目的只能够顺利转染至染色体上。

细胞转染:与瞬时转染的步骤相似。

细胞池筛选:细胞转染24-72小时后,去掉转染液,进行抗生素筛选。

提前一天接种细胞于24孔板中,待第二天长成25%单层为宜,二氧化碳培养箱中37℃过夜培养;

第二天将培养液换成含抗生素的培养基,抗生素浓度按梯度递增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml);

培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准,一般为400-800ug/ml,筛选细胞时适当提高浓度;

二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代,使用预实验(见下文)得到的抗生素浓度的培养基培养。

有限稀释法挑取单克隆:将细胞消化下来做连续的10倍稀释,每稀释一梯度都在96孔板中培养,生长一周左右再次挑取单克隆进行培养,如此反复3次;

Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况,挑取多个单克隆进行表达检测,筛选出表达量最高的克隆传代并保存。

为什么转染要用质粒?

转染(transfection):指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染(永久转染)两大类。

转染目的:研究你的目的片段到细胞内的表达。

转染一般是将目的基因构建到某个载体,将构建好的重组质粒导入细胞中,这样就能表达你所要的目的蛋白用于后续实验。

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